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樣品制備
1.蛋白提取：
裂解要快速，先變性后保存，在不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的情況下盡量選擇較強(qiáng)的裂解液。
裂解液選擇：
蛋白提取要在低溫條件下進(jìn)行，防止蛋白自溶或降解，同時可以加入適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿┮詼p少蛋白酶的水解作用。
磷酸化蛋白提取還需加入蛋白磷酸酶抑制劑，以防止蛋白去磷酸化。
2.需對蛋白進(jìn)行定量，確定合適的上樣量，常用的為BCA法。
3.蛋白變性：
SDS-PAGE電泳
1.根據(jù)蛋白分子量的大小選擇合適的膠濃度，蛋白分子量小應(yīng)選擇高濃度的膠，蛋白分子量大則選擇低濃度的膠。
2.凝膠選擇：
上部為5%濃縮膠，下部為不同濃度的分離膠，根據(jù)不同蛋白分子量選擇分離膠濃度。
3.凝膠配置：
TEMED和APS促進(jìn)凝膠反應(yīng)，需現(xiàn)用現(xiàn)加，一般先加TEMED，后加APS。
常溫下0.5h膠可凝固，若天氣寒冷或需加快凝固，可將其置于37℃孵箱中加速凝固。
膠最好現(xiàn)配現(xiàn)用，如果需要短暫保存，要用濕潤的保鮮膜包好并置于4℃冰箱中。
丙烯酰胺有神經(jīng)毒性，配膠時需要戴手套操作。
4.緩沖液：
內(nèi)槽電泳緩沖液要現(xiàn)配現(xiàn)用。
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，選擇變性/非變性的上樣緩沖液。
根據(jù)蛋白分子量選擇合適的預(yù)染Marker。
5.上樣：
上樣前可以適當(dāng)離心去除氣泡。
上樣過程中，避免引入氣泡，以防上樣不均勻。
樣品不要溢出樣本孔。
吸頭不要觸及樣本孔底部，否則條帶會變形。
每個樣本孔加入15-40μg蛋白，樣品為純化蛋白時，可能需要減少上樣量。
6.跑膠：
濃縮膠電壓一般采用100V左右，待溴酚藍(lán)遷移出濃縮膠后再換為200V。
按照儀器制造商推薦的時間跑膠，不同機(jī)器的跑膠時間不同，具體取決于電壓。
不要保存凝膠，應(yīng)立刻進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
轉(zhuǎn)膜
1.轉(zhuǎn)膜方式選擇
2.膜可能會產(chǎn)生自發(fā)熒光導(dǎo)致高背景，相較傳統(tǒng)的PVDF膜，硝酸纖維素膜（NC膜）的背景低。
3.膠在負(fù)極，膜靠近正極，為防止短路，確保將濾紙和膜的大小剪裁得與凝膠一致，濾紙不要大過膜。
4.為避免手指接觸膜影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，操作應(yīng)使用鑷子，并僅接觸膜的邊緣。
5.膜上可以剪一個小角用來標(biāo)記正反面。
6.轉(zhuǎn)膜緩沖液：
7.轉(zhuǎn)膜緩沖液要提前冷卻，且膠要在轉(zhuǎn)膜緩沖液里平衡一下，防止膠變形，同時有助于去除影響轉(zhuǎn)膜的雜質(zhì)。
8.夾好膜和凝膠后，要確保凝膠、膜和濾紙之間無氣泡。
9.轉(zhuǎn)膜儀生產(chǎn)商一般會在自己的網(wǎng)站上提供詳細(xì)的轉(zhuǎn)膜流程。根據(jù)系統(tǒng)不同，具體轉(zhuǎn)膜流程會有所不同。
10.濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜的電流一般在200-400mA之間，轉(zhuǎn)膜時間為30-60min，也可以在15-20mA轉(zhuǎn)膜過夜。具體的轉(zhuǎn)膜時間要根據(jù)蛋白的分子量大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的轉(zhuǎn)膜時間越長，分子量越小則需要的轉(zhuǎn)膜時間越短。
11.可使用麗春紅染色液初步檢測轉(zhuǎn)膜效率，它與下游WB檢測兼容，無任何干擾。染色后可以用蒸餾水，PBS或者其他溶液洗去。可用于PVDF膜、硝酸纖維素膜（NC膜）和醋酸纖維素膜上蛋白的檢測，不適用于尼龍膜上的蛋白檢測。
免疫印跡
1.封閉液的選擇：
常見的封閉液有5%脫脂奶粉和BSA封閉液。
脫脂奶粉不能與生物素化或伴刀豆蛋白標(biāo)記的抗體一起使用。
脫脂奶粉不能用于堿性磷酸酶（AP）顯色萬法。
脫脂奶粉盡量不用于磷酸化抗體對蛋白磷酸化的檢測。
2.封閉時間和封閉液劑量要足夠，封閉不充分顯色背景會過深。
3.洗膜時間要適當(dāng)，洗膜時液體的體積大約需要15mL左右，需要晃動洗膜，一般用TBST洗滌5min×3次。洗膜次數(shù)可根據(jù)實(shí)際情況添加或減少，過度洗膜會使信號減弱。
4.一抗的稀釋液可根據(jù)實(shí)際情況確定，可用5%脫脂奶粉稀釋，也可直接用1×TBST稀釋。
5.抗體的稀釋倍數(shù)按照產(chǎn)品說明書和實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，抗體濃度不宜過高，適宜的一抗和二抗?jié)舛瓤梢蕴岣咝旁氡取?/span>
6.如果使用的是熒光二抗，在加入其之后的步驟需要避光操作。
7.疊氮鈉對HRP有抑制性，使用HRP為標(biāo)記二抗時，緩沖液中不能使用疊氮鈉作為防腐劑。
8.常見顯影方法：
9.使用HRP-ECL發(fā)光法時，A、B發(fā)光液按比例稀釋混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。
10.不同蛋白最佳曝光時間不同，如果同一張膜上不同樣品信號差異太大，可以嘗試將膜剪開再分別進(jìn)行曝光。
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